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4第五章DNA的复制、突变、损伤修复和重组

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第五章DNA的复制、突变、 损伤修复和重组
第一节 DNA复制机制 第二节 突变 第三节 DNA损伤修复系统 第四节 遗传重组

第一节 DNA复制机制
一、DNA的半保留复制
? DNA 的 半 保 留 复 制 (semi-conservative replication) : 以 亲 代 DNA 的 每 一 股 作 模

板——完全相同的两个双链子代DNA(每个
子代DNA中都含有一股亲代DNA链)。

1958 Meselson-stahl 设计的CsCl超离心试验证实了
DNA复制的这一特性
? 1.大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代,使其DNA中的碱基氮均转变 为15N。 ? 2.将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。

15N

标记 DNA

15

N
CsCL密度梯度离心 浮力密度 N15-DNA 1.742g/ml N15-N14-DNA 1.717g/ml N14-DNA 1.710g/ml

标 记 实 验

·细胞生长在15N 标记培养基中 ·转入正常N源培养基中 ·分离各代DNA ·分析各代DNA的浮力密度

二、复制的起始点和方向
? DNA在复制时,需在特定的位点起始,这是一些 具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点 (复制子)。
3个连续的 13bp序列

4个9bp序列

在原核生物中,复制子通常为一个; 在真核生物中,复制子通常为多个。 复制子之间形成眼状结构

原核生物:单复制起点 即--整个染色体只有一个复制单位

真核生物 : 多复制起点

即--一个genome中有多个复制单位

Replication fork

复制的方向 复制叉:染色体中参与复制的活性区域,即复制正在发生的位点。 (Replication fork) 复制眼:电子显微镜下观察正在复制的DNA,复制的区域形如一只 眼睛。 (replication eye)

1.多数是双向的(等速进行或异速进行),形成两个复制叉;

2.少数是单向复制,形成一个复制叉。

单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉
单向复制 双向复制

真核生物的多复制子 多个复制眼

复制的多模式
单起点、单方向 (原核)

多起点、单方向 (真核)

单起点、双方向(原核)

多起点、双方向(真核)

单、双向θ 复制模式图
单向复制

双向复制

A replication eye forms a theta structure in circular DNA.

D 环复制

又称置换式

线粒体和叶绿体 DNA的复制方式

σ复制 滚环式复制 共价延伸

复制时产生的环结构形状象σ
病毒、细菌因子

DNA复制的酶学
一、DNA聚合反应和聚合酶
1957 Arthur Kornberg 首次发现

DNApolⅠ
DNApol Ⅱ DNApol Ⅲ

二、 三种DNA聚合酶的结构和功能

3’→5’外切活性(3种DNA聚合酶共性) 这种酶活性的主要功能是从3’ →5’方向识别

并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对的核苷酸,
这种功能称为校对功能(proofreading),对于维 持DNA复制的正确性至关重要。

Proofreading by DNA polymerase

5’ →3’外切活性(DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的共性) 这种酶活性是从DNA链的5’端向3’末端水解已配对的

核苷酸,本质是切断磷酸二酯键,每次能切除10个核
苷酸——在DNA损伤的修复中起重要作用,去除冈崎片

段5’端的RNA引物。

DNA聚合酶I
1.DNA pol I由一条多肽链组成,分子量为110 KD。
2.酶分子中含有一个Zn2+,是聚合酶活性必需的。

3.用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个片段,大片段的分子量为
76 KD,通常称为klenow片段,小片段为34KD。

4.5‘→3’聚合活性存在于klenow片段上。
5.DNA聚合酶I的作用是去除RNA引物,按DNA互补原则替换,每次与

模板-引物结合仅能添加20~100个核苷酸。

DNApolⅠ的5’-3’外切活性有以下三个特点:

? 必须有5’-磷酸末端
? 被除去的核苷酸必须是已经配对的 ? 被除去的可以是脱氧核糖核苷酸,也可以是核糖 核苷酸 (切刻*移)

DNA polⅠ的5’ →3’聚合活性和5’ →3’外切酶活性协同作用,可以

使DNA一条链上的切口从5’ →3’
方向移动,这种反应叫做缺刻* 移(nick translation)。

DNA Polymerase III (DNA聚合酶 III) DNA聚合酶III由10个不同的亚基构成。 其中α、ε和θ亚基构成核心酶。 α 亚 基 具 有 5‘→3’ 聚 合 酶 活 性 , ε 亚 基 具 有 3‘→5’外切活性,θ亚基功能是使α和ε亚基装配 结合。

两个拷贝的β亚基围绕DNA双螺旋形成一个环状的

二聚体。一旦β亚基二聚体与DNA紧密结合,它的作
用就像一个?滑动夹子?(sliding clamp)携带着核 心聚合酶沿着DNA链自由滑动。滑动夹可以阻止聚合 酶脱落,从而大大增加了DNA聚合酶的延伸能力。

(Note: no beta subunits are shown; without beta, this form of the complex is called DNA pol III*)

Beta forms a donut shaped ring around the DNA and helps to

anchor the holoenzyme to the DNA during replication . By acting
as a sliding “clamp”, beta helps the holoenzyme to replicate long stretches of DNA without “falling off” the strand.

The subunits of E. coli DNA polymerase III
Subunit Function

Core Enzyme dimer Holoenzyme

a e q t b g d d’ c y

5’ to 3’ polymerizing activity 3’ to 5’ exonuclease activity a and e assembly Assembly of holoenzyme on DNA Sliding clamp = processivity factor Clamp-loading complex Clamp-loading complex Clamp-loading complex Clamp-loading complex Clamp-loading complex

DNApolⅠ和 DNApol Ⅲ的主要特性和功能
DNA聚合酶活性:

DNApolⅠ--主要用于DNA的修复和
RNA引物的替换 DNApol Ⅲ--DNA链的延长 聚合方向:都是5’-3’

子链DNA延伸方向只能是5’-3’
已知的DNA聚合酶只能使链按5’-3’方向生长
T CA 5’ OH

C

+

ppp

OH

T CA C
5’ OH 3’ + ppi

三、 DNA连接酶
所需条件:
a、 切刻的 3’-OH 和 5’-P 相邻 b、 切刻各自碱基处于配对状态 c、 需要能量 原核(ATP、NAD) 真核(ATP) 用途: 复制过程中,5’ 端RNA引物被置换后切刻的连接 修复、重组

四、 与DNA几何学性质相关的酶
1、 解螺旋酶 (helicase):又*庑 单链结合蛋白(SSB single-strand binding protein) 2、 DNA旋转酶 :消除复制叉前进过程中产生的正超 螺旋,产生负超螺旋

二、DNA复制
原核生物DNA的复制 1. 大肠杆菌的DNA复制 2. 噬菌体?×174 的复制 3. 腺病毒的复制 4. 线性DNA的末端复制的问题 5、复制忠实性的保证

(一)DNA复制的起始

1. OriC in E. coli chromosomal DNA
? 三个13bp的重复序列

9bp基序共有4个拷贝,分散于整个 OriC 的范围内,
它是DnaA蛋白的结合位点。

通过DnaA蛋白+OriC捆绑了大约30个DnaA蛋白。

DNA分子在DnaA蛋白复合体上的缠绕,导致双螺旋在
串连排列的3个富含AT的13bp基序处解开。

Helicase (DnaB) continues to separate strands DnaB蛋白进一步打开DNA双螺旋。 DnaB蛋白是解旋酶(Helicase)。两个DnaB蛋白在复 制起点处分别与两条单链结合,并按5’→3’相向而行打 开DNA双链。

双链打开以后,DnaA蛋白便会募集由6个DnaB和6个
DnaC构成的复合体与起始位点处的单链DNA结合。DnaC

为DnaB蛋白装载因子,依靠DnaC蛋白的单链DNA结合域
以及与DnaA蛋白的相互作用,DnaB和DnaC蛋白复合体

结合在复制起始位点。

然后,DnaC催化DnaB蛋白解环,并套在单链DNA上。 在DnaB和DnaC蛋白复合体中,DNA解旋酶保持非活性

状态。DNA解旋酶的安装导致装载因子从复合体中释
放出来,并激活DNA解旋酶。DNA解旋酶向前运动,在

其身后留下单链DNA模板。

接着单链结合蛋白(single-stranded binding
protein, SSB)与解旋酶解开的单链结合,其作用

是防止单链降解,阻止单链退火。SSB蛋白与单链
DNA的结合有协同效应(cooperative),即一个SSB的 结合会促进另一个SSB与单链DNA的结合。这种协同 结合使单链DNA被解旋酶释放出后,很快被SSB所覆 盖。一旦被SSB覆盖,单链DNA即处于伸直状态,有

利于其作为模板进行DNA合成或RNA引物的合成。
在大肠杆菌细胞中,DNA解旋酶募集一个引物酶。引 物酶负责合成一段短的RNA引物。

(二)延伸
新生链的合成由DNA聚合酶催化完成。

从大肠杆菌细胞中分离出了5种DNA聚合酶。
DNA聚合酶III是大肠杆菌DNA复制中链延伸反应的主 要聚合酶。 DNA聚合酶I专门用于RNA引物的去处。 另外3种DNA聚合酶主要参与DNA修复及合成。

在复制叉处先导链和后随链的合成同时进行

先导链被连续合成,而后随链是不连续合成的。在复制叉 上,DNA解旋酶在后随链模板上沿着5’→3’运动。DNA聚合 酶III全酶通过τ亚基和解旋酶作用,一个核心酶复制前 导链,另一个核心酶复制后随链。

1.新合成的冈崎片段与上一个冈崎片段被一切口分开。 2.冈崎片段的RNA引物长约5个核苷酸,而它的DNA部分 长约1000~2000bp。 3.DNA聚合酶I与切口结合,并利用其5’ →3’外切酶活性 切去下游冈崎片断的RNA部分,这一过程相当于切口* 移。 4.当RNA引物被切除后,由DNA连接酶催化磷酸二酯键 的形成,把冈崎片断连接起来。

复制起始与延伸的总结
1. 3+4 2. Dna A-C(A被捆-复制叉+召集;6B主体;6C装配) 3. SSB 4. DnaB召集引物酶-合成RNA引物 延续 1. DNA聚合酶Ⅲ(10,3,22) 2.DNA聚合酶Ⅰ(去引物)——缺刻*移——DNA连接酶 连接“冈崎片段”

捆-开-解-盖-先导连续-后随冈崎-Ⅰ去+缺刻-连

(三) 终止和分离 1.大肠杆菌的复制终止区域位于环状染色体上,与复制

起点相对的一侧。
2.在这一区域存在几个终止位点(Ter)。

Ter序列按照特定的方向排列在染色体上,制造 “陷
阱”。

复制叉只进该区域,不能出去。

1.特异性DNA结合蛋白Tus与终止位点结合——阻断

一个方向上的复制叉前进(而对向另一个方向前进
的复制叉不起作用)。 2.机理:这样安排可确保两个从相反方向进入ter区 的复制叉总能相遇,当一个复制叉遇到另一个复制 叉时,DNA复制就完成了。

3.通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用。 4.每次复制时只使用一个终止位点。

四、真核生物DNA的复制

1、 复制概况
a、多个复制子,双向复制
b、复制子相对较小,

c、复制速度较慢,
d、复制叉相遇,复制

终止

随着复制叉沿着DNA分子向两个方向移动,

复制泡不断变大,
最终两个相邻复制泡的复制叉会相遇、融合, 完成DNA的复制。

multiple replicon

2、 真核生物的DNA聚合酶

α、β 、γ 、δ 、ε α
位置 合成 功能 核内

五种

β
核内

δ
核内 合成 前导链 Yes

ε
核内 合成,修复

γ
线粒体 复制

结合引发酶 修复

3’-5’校 NO 正活性

NO

Yes

Yes

3. 真核生物DNA复制的引发酶
● ● ● ●

引发酶(primase): 50-60kD DNApolα + primase形成紧密的复合物 作用方式为阵发性的,每次作用拷贝6~15个核苷酸 利用NTP

4、真核生物的复
制起始受许可因子 的控制

真核生物DNA复制特点
? 1.起点和速度 真核生物起始点多 原核生物1个起始点 完成全部复制,再开始新的复制 起始点可连续复制 复制速度慢(1/20) 复制速度快 [多点同时,总耗时比真核生物少]

真核生物DNA复制特点
2.DNA聚合酶: α、β、γ、δ、ε五种
α和δ——主

γ为线粒体复制酶;ε为修复酶
δ需要-增殖细胞核抗原(PCNA)-作为复合因子
PCNA——大肠杆菌中的DNA聚合酶Ⅲ的β亚基,形成环状卡子,增强酶的持续合成能力

两个蛋白因子:复制蛋白A和复制因子C RP-A——SSB;RF-C——夹子装卸器 (PCNA在DNA链上的装卸)

真核生物DNA复制特点
3.RNA引物和冈崎片段
真核生物 引物10个核苷酸 冈崎片段100-200个核苷酸 原核生物 引物几十个核苷酸 1000-2000个核苷酸

真核生物DNA复制特点
4.端粒和端粒酶
原核生物:复制后可填补去除引物后的5?末端的空缺 真核生物:通过端粒和端粒酶解决此问题

ε δ Eukaryotic DNA replication.
Step 1: primer synthesis by DNA polymerase; step 2: replication fact or C (RFC) displacement of DNA polymerase and recruitment of prolif erating cell nuclear antigen (PCNA); step 3: elongation by the newly r ecruited DNA polymerase-holoenzyme; step 4: strand displacement b y Pol-; step 5: cutting of the 5? displaced flap by (Fen1); step 6: seali ng by DNA ligase I .

端粒和端粒酶
? 染色体上有一个帽子,它的名字叫端粒-作用是保持染 色体的完整性。 ? Telomere:真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部 分,通常庞大呈粒状。(见图)
? DNA每复制一次,端粒就缩短一点。当端粒缩短至一 定的长度时,细胞就会停止分裂甚至发生细胞死亡,因 而被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。

? 在某些癌细胞中,端粒酶不断修复延长受损的端粒,防 止端粒因细胞分裂而有所损耗,从而使得细胞获得无限 增殖分裂的能力。

端粒酶简介

端粒酶主要依靠两种成分:端粒酶逆转录酶+作为模板的 一小段RNA序列。

德克萨斯大学细胞生物学系教授Jerry 联合著名生物技术 公司Geron合作开发了一种阻断端粒酶作用的新型化合物, 将其命名为GRN163L。

端粒理论
端粒是位于染色体两端的重复DNA序列,细胞分裂

时,部分端粒丢失,被细胞感知为DNA损伤。
端粒酶可补充丢失的端粒。 端粒的长度决定细胞的寿命,端粒的缩短导致细胞的衰老

和死亡。

端粒学说 由Olovnikov提出,细胞在每次分裂过程中都会由于DNA 聚合酶功能*荒芡耆粗扑堑娜旧澹虼俗 后复制DNA序列可能会丢失,最终造成细胞衰老死亡。

1.端粒具有维持染色体结构完整性的作用。 2.端粒酶是一种逆转录酶,由RNA和蛋白质组成,是以 自身RNA为模板,合成端粒重复序列,加到新合成DNA链 末端。 3.在人体内端粒酶出现在大多数的胚胎组织、生殖细胞、 炎性细胞、更新组织的增生细胞以及肿瘤细胞中。

? 但是许多问题用端粒学说还不能解释。 ? 1.有人就不同年龄供体角膜内皮细胞的端粒长度 进行研究发现角膜内皮细胞内端粒长度长期维持 在一个较高的水*,而端粒酶却不表达。 2.Kippling发现,鼠的端粒比人类长*5-10倍,寿 命却比人类短的多。

? 看来端粒的长度缩短是衰老的原因还是结果尚需
进一步研究。

真核生物染色体 DNA末端补齐模式
(1) 端粒DNA (Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端(四膜虫) 5’ TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3’ (富含 G 链) 3’ AACCCC AACCCC AACCCC 5’ (富含 C 链)

G基四重线

(2) 端粒酶( Telomerase) 1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchling 端粒酶---逆转录酶

a、核蛋白(蛋白质+核酸RNA)
b、含约长150NT的RNA,其中含 1~5 拷贝的CxAy重复序列, 是合成端粒T2G4的模板 c、延长的3’-T2G4端作为5’-端DNA合成的模板

(3) 补齐过程 通过TG链的回折形成 发夹结构(G· G氢键) ---尺蠖模型

实验表明--人体细胞通过监测失去的端粒的重复数

而计数细胞分裂次数,当端粒长度下降到某一临界值
时,细胞终止分裂---衰老、死亡

“多莉”的衰老

研究端粒丢失的速率,预测人类的寿命 XX

> XY

why?

研究推测端粒酶与肿瘤的关系

原核生物和真核生物DNA复制的比较
a、复制子的大小(Sizes of replicon): 酵母和果蝇 *均 40 kb 哺乳动物 *均 100 kb 原核生物的 DNA: >1000 kb

b、冈崎片段(Okazaki fragments): 原核生物的 DNA: 真核生物的DNA: 1000-2000 nt 100-200 nt

c、复制速度(Rate of replication): 真核生物的DNA: 原核生物的DNA: 3,000bp/min (50/sec) 50,000bp/min (900/sec)

相同点: 1. Semi-conservative replication 2. Semi-discontinuous repliction 3. DNA helicase, Ssb 4. RNA priming 5. 校正阅读(Proofreading) 不同点: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 复制起点(单、多) 复制子(大小、多少) 复制起始的许可因子的控制 (复制周期的重叠与否) 复制叉移动的速度 (900/50 nt/S) 冈崎片段的大小 端粒和端粒酶 DNA聚合酶Polymerases

第二节 突变
1.DNA作为一种能决定生命状态存在和延续的生 物大分子,在遗传过程中必需保持高度的精确 性和完整性。 2.在DNA复制过程中,仍难免会存在少量未被校 正的错误。 3.DNA还会受到各种物理和化学因素的损伤。
这些差错和损伤如果不被修复,将会产生严重 的细胞学后果,所以,维护DNA遗传信息的稳 定性对生物细胞来说是极其重要的。

一、突变的类型
1、碱基对的置换(substitution) 转换(Transition): 最普通的一种点突变,指一种嘧啶被另一种 嘧啶代替,一种嘌呤被另一种嘌呤代替。使GC 对被AT对替换,或者相反。 颠换(Transversion): 另一种不常见的点突变,嘌呤被嘧啶代替或 者相反,如AT对变成了TA、CG对。 2、移码突变(frameshift mutation) 由碱基的缺失或插入造成。

DNA突变 的类型
碱基对的置换 (substitution)

野生型基因
-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

移码突变 (framesshift mutation)

转换

插入

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G-

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-

-A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-

颠换
-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-

A 缺失
-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-

T

二、突变的原因

两个概念:
自发突变(spontaneous mutation):由于正常的 细胞活动,或细胞与环境的随机相互作用,这些 过程所引起的生物DNA序列的改变。 诱发突变(induced mutation): 特定的化学或物理 因素引起的DNA序列改变。 Note: 所有突变都包含DNA序列的改变!

(一)DNA分子的自发性损伤
1、DNA复制中的错误
以DNA为模板按碱基配对进行DNA复制是一个严格 而精确的事件,但也不是完全不发生错误的。

2、DNA的自发性化学变化
生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化,至少 有:① 碱基的异构互变; ②碱基的脱氨基作用; ③脱 嘌呤与脱嘧啶; ④碱基修饰与链断裂

(二)物理因素引起的DNA损伤
1、紫外线引起的DNA损伤

当DNA受到最易被其吸收波长(~260 nm)的紫外线照射时, 主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体。 2、 电离辐射引起的DNA损伤

电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应,直接效应是DNA直 接吸收射线能量而遭损伤;间接效应是指DNA周围其他分子(主 要是水分子)吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而 损伤DNA。
损伤包括: ①碱基变化; ②脱氧核糖变化; ③DNA链断裂; ④交 联。

+ 光 照

(三)化学因素引起的DNA损伤
1、烷化剂对DNA的损伤
① 碱基烷基化; ② 碱基脱落; ③断链; ④ 交联 2、碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤 如:人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或 抗癌药物,如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5FU)、2-氨基腺嘌呤(2-AP)等。 还有一些人工合成或环境中存在的化学物质能专 一修饰DNA链上的碱基或通过影响DNA复制而改变碱 基序列,例如亚硝酸盐能使C脱氨变成U,经过复制就 可使DNA上的G-C变成A-U对。

第三节 DNA损伤修复系统

DNA的损伤:由自发的或环境的因素引起 DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA 的损伤。
? 常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修 饰、交联、链的断裂、重组等。

DNA损伤的修复
? 人们对DNA的修复机理进行了深入研究,发现 多种修复途径。 1. 能纠正复制错误的尿嘧啶-N-糖基修复酶系 统和错配修复系统。 2. 能修复环境因素和体内化学物质造成DNA分子 损伤的光复活修复系统、切除修复系统、重组 修复系统和SOS修复系统等。 3.DNA分子的双螺旋结构是其损伤修复的重要基 础,因为DNA的互补双链可保证其一股链上的 损伤被切除后,能从另一股链上获得修复所需 要的信息。

一、错配修复(Mismatch repair)
原核细胞内存在甲基化酶,能使位于5`GATC 序列中腺苷酸的N6位甲基化。 复制后DNA在短期内(数分钟)为半甲基化的 GATC序列,一旦发现错配碱基,即将未甲基化链 切除一段包含错误碱基的序列,并以甲基化的链 为模板进行修复。

据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图

碱基错配修复过程示意图

二、 核苷酸切除修复系统
当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤,导致双链 之间无法形成氢键,在一系列酶的作用下,将DNA分子 中受损伤部分切除掉,并以完整的那一条链为模板,合 成切去的部分,然后使DNA恢复正常结构。

碱基丢失

DNA的损伤和切除修复
碱基缺陷或错配

结构缺陷

糖苷酶
切开
核酸内切酶

切开 核酸内切酶

切除

核酸外切酶

切除 核酸外切酶

修复 DNA聚合酶I

连接 DNA连接酶

三、碱基切除修复系统
糖苷水解酶: 细胞中能特异切除受损核苷酸上的N-β-糖 苷键,在DNA链上形成AP位点(去嘌呤或去嘧啶位点)。

AP核酸内切酶:能在AP位点附*(5`或3`位置)将DNA
链切开;

核酸外切酶:移去含AP位点核苷酸在内的小片段DNA;
DNA聚合酶I: 合成新片段;

DNA连接酶: 连接切口而修复。

第四节

遗传重组

DNA重组(recombination) 1、概念:不同DNA链的断裂和连接-产生的DNA 片段间的交换和重新组合,形成新的DNA。 2、意义:重组是“遗传学的灵魂”,生物的进化、

分子克隆技术都源于此。

一 同源重组
一、概述
1、定义:两个同源DNA分子间的序列重组。 2、条件: (1)两个DNA分子有同源序列

(2)两个DNA分子必须紧密接触
3、发生:

真核生物: 非姐妹染色单体交换相对应的区域。
原核生物: 依赖recA蛋白,并形成 Holliday 结 构

Holliday模型(1964年)

1.2个DNA分子的2条单 链在同一部位断裂。 2.断裂的游离末端彼此 交换形成异源双链。 3.2条杂合单链彼此连 接形成Holliday连 接体 。 4.Holliday连接体形 成——改变链的彼 此关系,形成不同 的构象。 5.构象决定了是否发生 重组。

(一)细菌同源重组的机制--- Holliday重组模型
断裂和重连产生异源双链DNA 1. 同源序列排列在一起;

2. 酶切。通过核酸酶和RecBCD 蛋白复合体的作用在一对同源 DNA上产生切口;
3.入侵。含有3’端切口的ssDNA 被recA蛋白包裹形成recA蛋白 -ssDNA细丝;RecA-ssDNA 细丝寻找相对的DNA双螺旋上 的相应序列。

4. 游离端交叉连接,形成 Holliday 结构

5.通过分支迁移产生异源
双链DNA。

十字形结构

6. 空间重排。十字型两臂 旋转180度 7. 解离(两种不同方式) 8. 修补连接

附:基因敲除( Gene knockout)
80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。 对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水*上设计实验, 将该基因去除,或用其它顺序相*基因取代,然后从整体观察 实验动物,推测相应基因的功能。 基因敲除的技术路线如下: (1)构建重组基因载体﹔ (2)用电穿孔、显微注射等方 法把重组DNA转入受体细胞核内, 基因敲除的靶细胞目前最常用 的是小鼠ES细胞;(3)用选择 培养基筛选已击中的细胞﹔ (4)转入假孕母鼠使其生长成 为转基因动物,对转基因动物 进行形态观察及分子生物学检 测。


一、定义:

位点特异性重组

不依赖于DNA顺序的同源性,而依赖于能与某些酶特异结 合的DNA序列。

二、噬菌体λ对E.coli DNA的整合
(一)λDNA存在两种形式 裂解状态

溶源状态
(二)通过位点特异性重组实现两种类型间的转换 λDNA整合到宿主DNA 进入溶源状态

λDNA从宿主DNA 中切离

进入裂解状态

(三)催化重组的酶
1、整合酶 Int (integrase):有*艘旃姑富钚 2、整合宿主因子(IHF,integration host factor ) 3、切除酶(excisionase)/ 终止重组 (四)重组位点:

附着位点(attachment site)attP( POP’)和 attB( BOB’)
(五)重组过程: 1、整合: POP’ + BOB’ →BOP’—POB 2、切离:BOP’—POB’ → POP’ + BOB’

attP attB




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