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第七章 细胞培养基本常用技术

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第七章 细胞培养中的基本方法

一、细胞培养操作基本要领和要求
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防止污染是决定培养成败的首要条件。

培养前准备

准备各种所需物品(宁多勿

少);用品置于场地,然后消毒 操作野消毒 现多用紫外线灯灭菌,效果很好。 ? 洗手和着装 洗手用75%酒精或0.2%的新洁尔灭
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火焰消毒 在无菌环境进行培养或做其它无菌 操作时,首先要点燃酒精灯。以后 一切操作,如安装吸管帽、启开或 封闭瓶口等,都需要经过火焰烧灼 进行。

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培养操作
动作准确敏捷 ? 不用手触及已消毒物品 ? 操作面布局合理 ? 操作保持一定顺序 ? 组织或细胞在未做处理前或培养液在未 用前,勿过早暴露在空气中;用过之后 如不再重复使用,应立即封闭瓶口。 ? 防止各种用液的交叉污染 ? 不向操作野讲话或咳嗽
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二、细胞计数
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用细胞计数法测定细胞生长动力学是 目前采用的最普遍的方法。
血细胞计数板人工计数

细胞计数器 血细胞计数板:常用的是改良的纽巴氏 (Neubauer)血细胞计数板。

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具体操作程序如下: 1、取血细胞计数板和盖玻片,用75%酒精 擦净。将盖玻片放于计数板上。 2、用滴管取混合均匀的细胞悬液,滴入计 数室内。要保证盖片下充满悬液,注意盖 片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边 槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可 以进行计数。 3、统计四个大格的细胞数:将血球计数板 放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数 板,分别数出四角的四个大格(每个大格 含有16个中格)中的细胞数。 对压边线细胞:计上不计下,计左不计右

计算:一般以每毫升含细胞数来表示
大方格的面积为1mm2,室深为0.1mm,则体积 为0.1mm3。推算得0.1mm3×104,才为1ml体积。 所以计算公式为: ? 细胞悬液的细胞数)/ml =( 四个大格子细胞数/4) ×104 ×稀释倍数 计数中,如果细胞悬液的细胞浓度过高,必须稀 释后再计;如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。 每个细胞悬液至少滴样两次求*均值。
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用细胞计数板计数时应注意的事项:

﹙1﹚不要漏计,不要重复 ﹙2﹚细胞悬液应混合均匀 ﹙3﹚浓度不可过高也不可过低。

三、细胞生长曲线的绘制
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细胞生长曲线(cell growth curve)是观测 细胞在一代生存期内的增生过程的重要指 标,可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速 度,确定细胞传代、细胞冻存或具体实验 的最佳时间。

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它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐 标作坐标图。

制作方法:
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1.培养细胞 首先在24孔培养板内分别接种相同数量的细胞。 计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记 为0 h 。 2.计数细胞密度 从接种时间算起,每隔24h计数3孔内的细胞密度, 算出*均值。为提高准确率,对每孔细胞可计数 2~3次。如此操作至第七天结束。 3.绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标,将全 部结果在坐标纸上绘图,即得所培养细胞的生长 曲线。

培养细胞的生长曲线

四、活细胞的染料排除检测法
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原理:由于死细胞的细胞膜通透性发生改 变,某些染料可大量进入却不被排出,因 而细胞呈色。而活细胞反之,能排出进入 细胞内的染料,因而不易着色。此法的原 理即是利用死、活细胞对染料的不同反应 而区分开两种细胞。 最常用的为“台盼蓝排除检测法”

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(1)0.4%台盼蓝溶液的配制: 称取4g台盼蓝,加少量蒸馏水研磨,加双 蒸水至100ml,用滤纸过滤,40C保存。使 用时。用PBS稀释至0.4%。即成工作液。

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(2)活体染色与细胞计数 ①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25%胰 蛋白酶溶液消化后,吹打制成细胞悬液) 与2滴台盼蓝液混合后,滴入细胞计数板。

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②2min后,在显微镜下计数至少200个细 胞。未着色的为活细胞,呈蓝色的为死 细胞。计算活细胞百分比。 注意事项:台盼蓝染细胞时,时间不宜过 长。否则,部分活细胞也会着色,会干 扰实验结果。

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五、细胞活力测定的MTT比色法
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原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶 能将染料MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴 盐)转变为不可溶性的紫色结晶,后者被 DMSO(或酸性异丙醇)溶解后所呈现的 色度(用OD值表示)反映出活细胞的代谢 水*。死亡细胞则无此酶活性。

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1.MTT溶液的配制
用PBS液(pH7.2)或者生理盐水将MTT配成 5mg/m1的溶液。(用0.2? m滤膜过滤)。
保存:于4℃避光保存。可用2周。若暂不 用,可冻存。

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2.实验过程
将细胞培养于96孔培养板。 按不同实验要求处理细胞。 每孔加入15-20? lMTT液,继续培养3~4h。 吸去培养液,每孔加入200? lDMSO,在微型振 荡器振荡5min,充分溶解混匀。 在酶标仪上测定光吸收。测定波长为 490nm,以只加培养液的的培养皿为空白对 照。

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3.结果分析
实验组光吸收值

细胞存活率=

对照组光吸收值

×100%

4.注意事项 ? (1)高浓度血清可影响光吸收值 ,常使用含 10%血清的培养液,在加入异丙醇溶液或 DMSO前尽量吸净培养液。 ? (2)吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的 结晶。




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